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合成中常见的问题解答
2011/08/19, 浏览

1. oligo的形态应该是什么样的?

答:如无特殊声明,本公司出品的寡核苷酸(oligo)均以冻干粉形式提供,因为影响结晶形态的因素较多,产品外观形态、颜色会有差异,有些无肉眼可见的形态,也为正常现象。

2. oligo如何进行稀释?

答:由于静电或气流的冲击,微小的寡核苷酸冻干粉在开盖时有可能飞出管外,因此在您稀释之前请短暂离心(3000转、1分钟即可)之后再开盖复溶。

我们会在您的合成报告单上为您提供每管引物溶解为100 uM所需的溶剂ul数,如果您需要稀释到特殊浓度,请参照以下表格进行快速计算:

溶解浓度

10 uM

50 uM

200 uM

加水量

=nmol*100

=nmol*20

=nmol*5

3. oligo的保存条件及存放时间分别是什么?

答:(1)Oligo DNA干燥制品很稳定,常温下可保存数月,但最好置于-20℃保存。(2)溶解后的DNA溶液可于4℃短期保存,长期保存请置于-20℃。在溶解和使用DNA溶液时,请避免核酸酶污染,减少DNA溶液的反复冻融。(3)荧光标记Oligo DNA对光敏感,在日光下荧光强度会降低。为了保持荧光标记Oligo DNA 的荧光效率,请于-20℃避光保存。 Cy3与Cy5在溶液pH>9的条件下会发生分解,所以稀释Cy3与Cy5标记的Oligo DNA 时请注意溶液的pH值。

4. oligo可以用琼脂糖凝胶电泳染色吗?

答:不可以。EB染色主要是通过嵌入到DNA 双链的碱基之间来进行染色的。而普通合成的oligo为单链,不适合进行EB染色。如果您想要观察引物条带,请使用15%的变性PAGE胶,7M Urea*TBE Buffer,50% Formamide上样电泳,置于硅胶荧光板上,在紫外灯下观察。

5. 合成的oligo5’端是否带磷酸基团?

答:如果无特殊修饰,常规化学合成的寡核苷酸的5`及3`端均为羟基,合成短adaptor等直接用于连接时请充分考虑此点,如有必要,请选择磷酸化等基团修饰。

6. 常见的简并碱基代码是什么?

答:M=(A/C),W=(A/T),H=(A/T/C),V=(G/ A/C),D=(G/A/T),Y=(C/T),K=(G/T), S=(G/C),B=(G/T/C),N=(A/G/C/T),R=(A/G)。

7. 长链合成的纯度大概有多少?

答:Oligo的化学合成是碱基与碱基之间通过化学反应偶联而成,而化学反应的偶联效率一般在99%左右,也就是说,在每次进行偶联反应时,都会有1%的片段附加不上新的碱基,对这种截断的失败序列,为了防止其参与后续的偶联反应,采用Cap溶液进行化学封闭,以阻断其延伸,但化学封闭反应的效率不可能达到100%。因此引物序列越长会导致其浓度越低,对于长序列引物,我们建议客户在测序时多选择几个克隆进行试验,以减少错误。

8. 如何制备双链DNA?

答:1)配制STE溶液:即10mM Tris, 1 mM EDTA, 100mM NaCl 其中,一定浓度的盐离子是比较关键的一个因素;

2)根据OD值和分子量,计算摩尔数;按1 OD = 33 ug 计

3)溶解摩尔数大的一条链至适当体积,一般50 ~100 ul;更高浓度的寡核苷酸会有助于退火完全;

4)取一定体积(与互补配对的另一条链等摩尔数)已溶解的寡核苷酸加入到互补链

5)95℃ 3分钟变性,用PCR仪或水浴加热,然后自然冷却至室温即可(最好放置于一定体积的水浴中与水同时冷却,以确保退火完全,避免降温过快)。

9. 扩增无条带需要考虑哪些方面的原因?

答:1)设计的引物与模板不匹配,引物扩增效率低

2)所用试剂包括cDNA、酶、buffer、dNTP、水等是否出现污染或降解;

3)反应体系是否需要优化;

4)选用的退火温度以及试验条件是否需要优化;

扩增无条带的原因可能有很多,如果您排除了试验的原因后,我们可以为您提供免费重合。由于考虑到引物存放等的问题,合成引物的投诉受理期限为三个月,超过三个月恕不受理。

10.出现非特异性扩增主要是什么原因?

答:1)引物设计是否恰当。

2)引物特异性差。

3)模板或引物浓度过高。

4)酶量过多。

5)Mg2+浓度偏高:DNA聚合酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感,其浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高,此浓度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性,Mg2+过高就抑制酶活性,由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离的Mg2+浓度,因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整,优化浓度。一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5~1.0mmol/L。

6)退火温度偏低

7)循环次数过多